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RNA干扰AAV制备

腺相关病毒是一种理想的基因操作工具,具有广泛的宿主范围、高安全性、低免疫原性、高感染效率、长期稳定表达等优点。近年来,AAV已成为炙手可热的基因转移与基因治疗载体,在多种领域的体内体外研究中发挥重要功能。

RNA干扰(RNA interference, RNAi)是一种由双链RNA(double-stranded RNA, dsRNA)介导的同源mRNA高效特异性降解、进而导致基因表达沉默的现象。RNAi技术借助外源dsRNA在细胞内产生小分子干扰RNA(small interference RNA, siRNA)进而形成沉默复合物(RNA-induced silencing complex, RISC),从而特异性剔除或关闭某个基因的表达。将针对siRNA设计的短发夹RNA(short hairpin RNA, shRNA)装载入AAV中,借助AAV高效感染细胞或动物,是实现人工RNAi的一项主要技术。

基于先进的腺病毒技术平台,维洛信现提供RNAi AAV制备服务。我们采用三质粒共转染的Helper-free系统在293T细胞中进行AAV的生产与包装,并建立了完善的纯化与质控方法,生产的AAV颗粒可直接应用于各类体内体外RNA干扰实验。

用于RNA干扰的腺相关病毒(AAV)制备服务

Fig. shRNA介导的RNA干扰示意图


腺相关病毒优势:

1. 宿主范围广:可感染分裂细胞与非分裂细胞;多种亚型具有多种组织亲嗜性,可以应用于神经系统、心肌、肝脏、眼睛、肌肉等定位注射。
2. 扩散性佳:体积小、滴度高,具有远优于腺病毒与慢病毒的扩散性,可达到基因100%传递,展现出极高的抑制效果。
3. 安全系数高:迄今未发现野生型AAV对人体致病;ITR与rep/cap基因分别由独立的质粒传导表达,进一步去除感染风险。
4. 免疫原性低:仅4.7kb的基因组便于重组DNA技术操作,在动物实验中局部大剂量使用极少造成非特异性反应与免疫抑制,对细胞的影响很小。
5. 长时稳定表达:AAV感染可介导外源基因发生低频(<2%)定向整合,绝大多数重组AAV感染细胞后不会整合入基因组,而是在宿主细胞内形成伴随体,因此AAV能够介导外源基因长期、稳定的复制转录。
6. 稳定性好:AAV在60℃不会被灭活,能抵抗多种有机溶剂的处理(例如氯仿)

不同的AAV亚型具有不同的组织嗜亲性,我们推荐根据实验靶向的器官/细胞,选择具有相应亲和性的AAV亚型进行构建,能够有效提高感染效率。

服务流程:

1. 方案沟通
2. 基因克隆:针对目的基因ORF设计3-4个靶点,将对应shRNA构建入我们的专有AAV转移质粒,测序验证
3. 病毒包装:三质粒共转染(转移质粒+病毒包装质粒+辅助质粒)入293T细胞
4. 收毒:72h孵育后分别收获培养上清与细胞沉淀,反复冻融将细胞中的病毒释放
5. 纯化浓缩:碘克沙醇梯度离心,高效的分离空衣壳病毒与细胞杂质,将具备感染力的病毒富集到90%以上;超滤浓缩
6. 质量控制:
- 多重酶切质粒鉴定
- qPCR检测病毒滴度
- SDS-PAGE/考马斯亮蓝测定纯度
- 细胞转导检测(带有荧光标签)
- HPLC/内毒素检测/微生物检测(高纯度AAV可选)

包装服务流程图

交付内容:

定制RNAi AAV病毒颗粒
对照病毒(可用于转导测试)
详细实验报告

维洛信腺相关病毒平台:

1. 创新性AAV载体与严格制备工艺,力求获取最优滴度、活性、纯度与一致性的AAV产品
2. 多种AAV血清型可供选择(AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9...)
3. shRNA启动子(U6, H1, CMV)与多种报告基因(GFP、RFP等)可供选择,满足您的不同需求
4. 滴度高:维洛信可提供10^12~10^13V.G/ml及以上滴度的病毒,满足大部分实验的使用要求
5. 灵活生产:我们提供体外应用级别与体内应用级别各种规格的病毒(小规格、中规格、大规格)的制备服务
6. 具有竞争力的价格与货期

针对不同应用方向,我们提供以下AAV制备服务:

了解更多AAV服务,请拨打137-1756-5893咨询我们。

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