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关于病毒纯化


病毒为什么一定要纯化?

(1)病毒培养液中含有大量杂质,包括缺损颗粒、病毒外壳、细胞毒素、培养基、血清以及细胞碎片等,这些杂质若被注入动物体内,会引起宿主强烈的免疫反应;
(2)纯化有利于病毒悬浮于体内注射的缓冲液中。


病毒纯化的原则:以保持病毒的生物活性和感染性为前提,去除非病毒杂质,提取出高纯度的病毒。


病毒纯化方法

1. 超过滤法:利用超滤膜将水、盐和小分子滤除,将大分子或病毒等颗粒截留,从而达到纯化的目的,该方法主要用于大容量病毒样品的浓缩,且回收率高。常用的超滤膜是硝酸纤维素滤膜。
注意:超滤膜孔径一定要比病毒颗粒小,且只能去除比病毒小的细胞碎块


2. 吸附法:利用病毒颗粒或杂质的表面离子与吸附剂之间的亲和作用,将病毒或杂质吸附后,用一定的盐溶液将病毒或杂质洗脱下来。常用的吸附剂有红细胞、磷酸钙、离子交换树脂等。
注意:吸附剂应有较大的表面积和吸附能力,性质稳定并便于洗脱


3. 层析法:利用物质中各组分的理化性质差异,使各组分在固定相和流动相中的分布程度和移动速度不同,从而达到分离的目的。常用的层析法有凝胶层析法、离子交换层析法和亲和层析法。
(1)凝胶层析法:样品流经具有一定孔径大小的多孔葡聚糖凝胶时,各组分按分子的大小不同而被分离。常用的凝胶有磷酸钙凝胶、氢氧化锌凝胶和焦磷酸镁凝胶。
(2)离子交换层析法:在一定pH条件下,利用病毒颗粒所带电荷不同实现分离。适用于所有带电荷的样品的分离纯化。
(3)亲和层析法:利用样品与基质之间的特异性亲和力,实现分离。适用于纯化生物大分子。


4. 离心法:根据物质的沉降系数或浮力密度的不同,利用离心力将物质分离纯化。常用于病毒纯化的方法有差速离心法和密度梯度离心法。
(1)差速离心法:利用不同大小和比重的粒子的沉降速度不同,去除宿主细胞碎片等杂质,最后使病毒沉淀。该方法能迅速处理大量样品。
(2)密度梯度离心:利用超速离心,将病毒颗粒分配到密度梯度介质中相等密度层中,吸出目的颗粒所在介质层,即可到达分离纯化的目的。常用的介质有氯化铯和蔗糖。


5. 沉淀法:利用悬浮液中的病毒颗粒在重力作用下产生沉降作用,达到分离纯化的目的。用于病毒纯化的方法有聚乙二醇(PEG)沉淀法、等电点沉淀法和中性盐沉淀法等。
(1)聚乙二醇(PEG)沉淀法:利用聚乙二醇与病毒颗粒形成多聚体,再离心即可沉淀。
(2)等电点沉淀法:利用病毒粒子在等电点时,所携带的正负电荷相等,分子间相互作用减弱,溶解度降低,从而发生沉淀。
(3)中性盐沉淀法:利用高浓度的中性盐使物质的溶解度降低,从而发生沉淀。


6. 电泳法:利用病毒带电粒子在电场作用下,向着与电性相反的电极的移动速度不同,将组分分离成狭窄的区带,最后收集病毒区带部分。

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